ООО "Фармацевтический Альянс"

Украина, 61001,

г. Харьков,

ул. Франковская, 14.

Карта проезда

Тел.(057)787-10-11,

Факс.(057)787-10-19,

www.apteka95.com.ua

www.labanalyt.com

labanalyt@labanalyt.com

Как применяется ультрафиолетовая спектрофотометрия в фармакопейном анализе испытания на подлинность органических лекарственных веществ?

 

3.07.12

 

Установление зависимости между строением веществ и их электронными спектрами является сложной проблемой, рассмотрение которой находится вне пределов данной монографии. Следует, однако, остановиться на некоторых закономерностях, определяющих характер спектров.
Поглощение в ультрафиолетовой и видимой частях спектра обычно связывают с наличием в молекуле вещества определенных групп – хромофоров. К ним относятся двойные и тройные углеродные связи, карбонильная, карбоксильная, азо-, нитро- и другие группы. Известно также, что некоторые группы, не являясь хромофорными, увеличивают интенсивность окраски вещества – такие группы называют ауксохромными, или ауксохромами. Типичными примерами ауксохромов могут быть гидроксильная и аминогруппы.
Влияние различных заместителей на характер поглощения удобно наблюдать при рассмотрении спектров простых молекул. Интерпретация спектров органических веществ, имеющих сложное строение, затруднена ввиду присутствия в молекуле более чем одной хромофорной и ауксохромной группы. Часто определенные группы хромофоров проявляются спектрально как единый комплекс. Так, например, структура бензола имеет характерные полосы поглощения при 200 и при 255 нм.
Если введение новой группы в молекулу вещества не затрагивает имеющиеся хромофорные структуры, то не произойдет какого-либо значительного изменения спектра. Поэтому ряд фармакопейных веществ (фенамин, эфедрин и лидол) имеют типичную полосу поглощения бензола при 257 нм.
При введении в бензольное ядро фенольной группы полоса поглощения смещается к области 280 нм, где особенно возрастает влияние растворителя, так как имеется возможность образования ауксохрома в виде – ОН (кислая и нейтральная среда) или О- (щелочная среда). Типичными примерами одноатомных фенолов являются морфин и эст-радиол, и двухатомных фенолов – адреналин и изопренал ин.
Интенсивное поглощение многих кетостероидов полностью зависит от сопряженной системы колца А. Остальные группы в молекуле не оказывают влияния на характер спектра. Поэтому ряд стероидов (преднизон, преднизолон, прогестерон, дезоксикортикостерон, гидрокортизон, кортизон и метилтестостерон) имеет подобный спектр с максимумом около 240 им.
Производные барбитуровой кислоты проявляют максимум при рН 7 вследствие возникновения хромофорной группы



Для более детального изучения рекомендуется монография Гиллема и Штерна, ‘а также другие работы по этому вопросу.
Для идентификации неизвестного вещества в органической аналитической химии спектр исследуемого вещества обычно сравнивают с полученным при тех же условиях спектром вещества, строение которого известно.
Установление подлинности вещества по ультрафиолетовому спектру является ценным дополнением к химическим и физико-химическим методам фармакопейного анализа. Далее мы рассматриваем некоторые случаи поглощения в ультрафиолетовой области, используемые рядом фармакопеи для определения подлинности органических лекарственных веществ.
Указание длин волн при максимумах поглощения является лишь ориентировочной характеристикой, так как ие дает возможности судить о виде спектра.
0,002% раствор препарата в 0,01 н. растворе соляной кислоты в области от 220 до 350 нм имеет максимум поглощения около 251 нм (Имизин, ГФХ).
В данном случае, очевидно, следует или целиком промерить указанную область, что при отсутствии регистрирующего прибора требует значительного времени, или сделать ряд измерений в области, близкой к 251 нм, например ±10 нм, и установить максимум.
Чаще приводят максимумы и минимумы при определенных длинах волн и соответствующие величины поглощения.
Ультрафиолетовый спектр раствора в 0,1 и. соляной кислоте имеет два максимума -при 241 нм и при 291 нм, поглощение 0,001% раствора при толщине слоя 1 см при 241 нм, около 0,50 и при 291 нм, около 0,67. (Антазолина гидрохлорид, Международная фармакопея, Второе издание).
Иногда величину поглощения выражают в виде удельного показателя поглощения, Е (1%, 1 см).
Удельный показатель поглощения, Е (1%, 1 см), при длине волны 278 нм 290-305 (0,002% водный раствор) (Левомицетин, ГФХ).
Если кривая поглощения изменяется в зависимости от рН раствора, указывают значение рН, при котором проводится измерение.
Ультрафиолетовый спектр раствора в фосфатном буфере, рН 7,5, имеет максимум только при 252 нм, поглощение 0,0005 раствора при толщине слоя 1 см около 0,4 (Сульфафуразол, Международная фармакопея, Второе издание).
Раствор в 0,01 н. едком натре имеет максимум при 326 нм, Е (1%, 1 см) -около 65, и минимум при 294 нм, Е (1%, 1 см)-около 35.
Раствор в смеси 10 объемов 0,1 н. соляной кислоты и 40 объемов 95% спирта, доведенных водой до 100 мл, имеет максимум при 300 нм, Е (1%, 1 см) -около 50, и минимум при 275 нм, Е (1%, 1 см) – около 40 (Левотироксин-натрий, Скандинавская фармакопея).
Некоторые фармакопеи вместо абсолютных величин поглощения принимают отношение адсорбции при максимуме к абсорбции при минимуме, что дает возможность до некоторой степени судить о наличии поглощающих примесей.
0,001 % раствор препарата в 0,1 п. растворе едкого натра имеет максимумы поглощения при 256, 2\83 и 365 нм. Отношение



составляет 2,8-3,0 (Фолиевая кислота, ГФХ). D при 365 нм
Для феноксиметилпенициллина по той же фармакопее проводят измерение следующим образом.
Около 0,1 г препарата (точная навеска) растворяют в 4 мл 5% раствора гидрокарбоната натрия, разводят водой до 500 мл и определяют оптическую плотность (D) при длине волны 268 нм н при длине волны 274 нм в кювете с толщиной слоя 1 см. Контрольным раствором служат 4 мл 5% раствора гидрокарбоната натрия, разведенные водой до 500 мл.
Отношение D при длине волны 268 нм к D при длине волны 274 им должно быть не менее 1,21 и не более 1,24.
В случае стандарта идентификация веществ сводится к сравнению двух спектров поглощения, полученных при одних и тех же условиях.
Ультрафиолетовый спектр 0,0005% раствора в спирте имеет максимумы и минимумы яри тех же длинах волн, что и раствор стандарта, одинаковой концентрации и одновременно измеренный; соответствующие величины поглощения, рассчитанные на сухое вещество, при максимуме поглощения около 281 нм не отличаются более чем на 3% (Этинилэстрадиол, Фармакопея США XVII).
Последний метод обеспечивает наиболее достоверные результаты и должен быть рекомендован для фармакопейных испытаний на подлинность.

Что представляет собой метод спектрофотометрического определения витамина А?

 

Метод спектрофотометрического определения витамина А рекомендован Международным союзом теоретической и прикладной химии в 1956 г. и принят большинством фармакопеи. Ниже мы рассматриваем способ, описанный во Втором издании Международной фармакопеи.

Метод. Все процедуры должны проводиться быстро, насколько это возможно, следует принимать меры во избежание воздействия света и окислительных агентов.

Так как положение максимума поглощения является важным критерием и поправочные уравнения требуют измерений при точных длинах волн, необходимо, чтобы шкала длин волн спектрофотометра была проверена немедленно перед определением. Ртутные линии при 313,16 и 334,15 нм являются подходящими точками и для удобства настройка прибора по этим линиям может быть связана о. его настройкой по водородным линиям при 379,7 и 486,1 нм. Точность исправленного поглощения значительно ниже, чем три непосредственно измеренных поглощения, из которых оно рассчитывается; следовательно, измерения требуют особой осторожности и следует проводить не менее двух количественных определений.

Витамин А в форме эфира. Образец, нерастворимый непосредственно в циклогексане, может быть обработан экстракцией или другими средствами, не связанными с омылением. Если это невозможно, поступают так, как описано в разделе «Другие формы витамина А».

Растворяют точно взвешенное количество образца или приготовленного извлечения в достаточном количестве циклогексана для получения раствора с содержанием от 9 до 15 Международных единиц в миллилитрах. Определяют длину волны максимума поглощения. Измеряют поглощения при длинах волн, приведенных в табл. 14, и рассчитывают их как отношение к поглощению при 328 нм.

Рассчитывают также поглощение при 328 нм в виде Е(1%, 1 см) или в виде «а» -поглощаемость.

Если максимум поглощения лежит между 326 и 329 нм и наблюдаемые относительные поглощения находятся в пределах 0,02 от указанных в таблице, определяют активность образца в Международных единицах и в граммах по формуле:

Е(1%, 1 см)328-1900.

Если максимум поглощения лежит между 326 и 329 нм, но относительные поглощения не находятся в пределах 0,02 от указанных в табл. 14, рассчитывают исправленное

Длина волны (в нм)  Относительное поглощение
300 0,555
316 0,907
328 1,000
340 0,811
360 0,299
   

Таблица 14

поглощение при 328 нм, применяя найденные показания в уравнении:

А328 (испр.) = 3,52 (2A52S – А310 – А340).

Если исправленное поглощение лежит в пределах -15% или +3% неисправленного поглощения, активность рассчитывают по исправленному поглощению.

Если исправленное поглощение лежит вне -15% или + 3% неисправленного поглощения или максимум поглощения не приходится на область 326 и 329 нм, образец подвергают анализу, как это описано в разделе «Другие формы витамина А».

Другие формы витамина А. Смешивают точно взвешенное количество образца, содержащего не менее 500 Международных единиц витамина А и не более 1 г жира с 30 мл безводного спирта и 3 мл 50% раствора едкого кали, кипятят с обратным холодильником в течение 30 минут, под током азота, свободного от кислорода, быстро охлаждают и прибавляют 30 мл воды. Переносят гидролизат в делительную воронку с помощью трех количеств, каждое 50 мл, эфира и извлекают витамин А встряхиванием в течение ми-путы. После полного разделения слоев отбрасывают водный слой и промывают извлечение четырьмя порциями, каждая 50 мл, воды смешивая осторожно во избежание образования эмульсии во время первых двух промываний. Упаривают определенный экстракт до 5 мл и удаляют оставшийся растворитель в токе азота, свободного от кислорода, без применения нагревания. Растворяют остаток в достаточном количестве изопропилового спирта для получения раствора с содержанием от 9 до 15 Международных единиц в 1 миллилитре и измеряют поглощения при 300, 310, 325 и 334 нм. Определяют длину волны максимума поглощения.

Если максимум поглощения лежит между 323 и 327 нм и отношение поглощения при 300 нм к поглощению при 325 нм не превышает 0,73, получают исправленное поглощение по уравнению:

А325 (испр.) =6,815 А325-2,555 А310-4,260 А394.

Активность образца в Международных единицах в граммах рассчитывают по формуле:

Е325 (испр.) х 18 300,

за исключением случая, когда исправленное поглощение лежит в пределах ±3,0% неисправленного поглощения, исправленным поглощением можно пренебречь, и активность рассчитывают по неисправленному поглощению.

Если максимум поглощения лежит вне области 323 до 327 им или отношение поглощения при 300 нм к поглощению при 325 нм превышает 0,73, неомыленную часть образца нужно подвергать хроматографированию.

При выполнении спектрофотометрического анализа витамина А следует принимать во внимание, что растворы ретинола исключительно чувствительны по отношению к свету.

В качестве растворителей применяются петролейный эфир, циклогексан, изопропиловый спирт и реже хлороформ. Чаще всего предпочитают циклогексан, так как спектральные различия в области 310 до 315 нм между нео- и транс-витамином А менее проявляются в этом растворителе. Растворители подвергают дополнительной очистке путем перегонки; рекомендуется также проверять их спектральную чистоту в области от 300 до 350 нм.

Согласно ГФХ, содержание ретинола определяют в индивидуальном веществе спектрофотометрически при 326 ям в растворе в абсолютном спирте. Предварительно проводят испытание на поглощающие примеси. Расчет производят принимая 1550 за величину Е (1%, 1 см) для 100% ретинола при длине волны 326 нм.

Фармакопея США XVII указывает, что при условиях определения (поглощение измеряют после омыления) следует ожидать расхождения в данных, полученных различными лабораториями при Р = 0,05 около ±8%.

 

Дополнительные сведения по атомно-абсорбционной спектроскопии

Элементы, которые могут быть определены атомно-абсорбционным спектрометром PGI 990

Пламенной атомизацией могут быть определены: Li, Be, B, Na, Mg, Al, Si, P, K, Ca, Sc, Ti, V, Cr, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zn, Ga, Ge, As, Se, Rb, Sr, Y, Zr, Nb, Mo, Tc, Ru. Rh, Pd, Ag, Cd, In, Sn, Sb, Te, Cs, Ba, La, Hf, Ta, W, Re, Os. Ir, Pt, Au, Hg, Tl, Pb. Bi. Ce, Fr, Nd, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm Yb, Lu, Th, U.

Электротермической атомизацией могут быть определены: Li, Be, B, Na, Mg, Al, Si, P, K, Ca, Sc, Ti, V, Cr, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zn, Ga, Ge, As, Se, Rb, Sr, Y, Mo, Tc, Ru. Rh, Pd, Ag, Cd, In, Sn, Sb, Te, Cs, Ba, La, Re, Os. Ir, Pt, Au, Hg, Tl, Pb. Bi. Fr, Nd, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm Yb, Lu, U.
Для анализа низких концентраций следующих элементов методом атомной абсорбции требуется применение ртуть-гидридной системы: Hg, Ge, As, Bi, Sb, Se, Sn, Te, Pb.

Рекомендации по выбору типа пламени для атомизации некоторых элементов при работе на атмно-абсорбционных спектрометрам с пламенным атомизатором

№ элемента

Элемент

Тип пламени

3

Li

АВ

4

Be

АЗА

5

B

АЗА

11

Na**

АВ

12

Mg

АВ

13

Al

АЗА

14

Si

АЗА

19

K**

АВ

20

Ca

АЗА

21

Sc

АЗА

22

Ti

АЗА

23

V

АЗА

24

Cr (1)

АВ

25

Mn

АВ

26

Fe

АВ

27

Co

АВ

28

Ni (1)

АВ

29

Cu

АВ

30

Zn

АВ

31

Ga

АВ

32

Ge

АВ

33

As

АВ

№ элемента

Элемент

Тип пламени

34

Se

АВ

37

Rb

АВ

38

Sr

АВ

39

Y

АЗА

40

Zr

АЗА

41

Nb

АЗА

42

Mo

АЗА

44

Ru

АВ

45

Rh

АВ

46

Pd

АВ

47

Ag

АВ

48

Cd

АВ

49

In

АВ

50

Sn

АЗА

51

Sb

АВ

52

Te

АВ

55

Cs

АВ

56

Ba

АЗА

57

La

АЗА

59

Pr

АЗА

60

Nd

АЗА

62

Sm

АЗА

№ элемента

Элемент

Тип пламени

63

Eu

АЗА

64

Gd

АЗА

65

Tb

АЗА

66

Dy

АЗА

67

Ho

АЗА

68

Er

АЗА

69

Tm

АЗА

70

Yb

АЗА

71

Lu

АЗА

72

Hf

АЗА

73

Ta

АЗА

74

W

АЗА

75

Re

АЗА

76

Os

АЗА

77

Ir

АВ

78

Pt

АВ

79

Au

АВ

80

Hg

АВ

81

Tl

АВ

82

Pb

АВ

83

Bi

АВ

90

Th

АЗА

92

U

АЗА

АВ - ацетилен-воздух
АЗА - ацетилен-закись азота
** - анализ в режиме эмиссии